RNA-seq: réplicas, diseño y qué esperar del resultado
Cuántas réplicas hacen falta, qué tipo de ARN conviene aislar y los errores de diseño que ningún análisis posterior puede arreglar.
Un experimento de RNA-seq se gana o se pierde antes de secuenciar. El análisis bioinformático puede ser impecable y aun así no responder nada si el diseño tenía un fallo de base. Esto es lo que hay que decidir antes de gastar la corrida.
Réplicas: la decisión más importante
Una réplica biológica es una muestra independiente de la misma condición: otra planta, otro animal, otro cultivo. Es lo que permite medir cuánto varían los genes por azar, y sin esa medida no se puede decir qué diferencia es real.
- Sin réplicas: no hay estadística. Se puede describir lo que se vio, no afirmar que haya diferencia.
- Tres por condición: es el mínimo habitual, y también el mínimo con el que se detectan pocos de los genes que de verdad cambian.
- Cuatro a seis, o más: da una potencia mucho mayor. Un estudio muy citado hecho en levadura (Schurch y colaboradores, 2016) concluyó que con tres réplicas se detectaba solo una parte de los genes diferenciales, y recomendó al menos seis, y más si se buscan cambios pequeños.
Esa cifra no es universal: depende de cuánto varía tu sistema. Un cultivo de laboratorio genéticamente uniforme necesita menos réplicas que animales de campo o tejidos humanos. Pero el principio se mantiene: más réplicas casi siempre rinden más que más profundidad de lectura.
Qué ARN aislar
El ARN total es sobre todo ribosomal, que no interesa. Hay que enriquecer lo que sí:
- Selección por cola de poliA: captura los ARN mensajeros de eucariotas. Funciona bien con ARN de buena calidad.
- Eliminación del ARN ribosomal: es la opción cuando la muestra es bacteriana —los mensajeros bacterianos no llevan cola de poliA—, cuando el ARN está parcialmente degradado, o cuando interesan también ARN no codificantes.
Elegir mal aquí significa que la mayor parte de la corrida se va en leer ARN ribosomal, o que se pierde justo la fracción que se quería.
La calidad del ARN decide todo
El ARN se degrada con una rapidez que sorprende a quien viene del ADN. Antes de preparar la librería se mide la integridad con el número de integridad del ARN (RIN), que va de 1 a 10. Como orientación, valores de 7–8 o más son lo habitual para poliA; con valores más bajos hay que cambiar de estrategia o aceptar que el resultado será menos fiable.
Un RIN bajo no se arregla después. Por eso la conservación en el momento de la toma —congelación inmediata o estabilizador de ARN— es parte del diseño, no un detalle logístico.
Cuánta profundidad
Para detectar genes diferenciales en organismos con genoma de referencia suele bastar del orden de 20–30 millones de lecturas por muestra. Hace falta bastante más si interesan los genes poco expresados, las isoformas alternativas o si no hay genoma de referencia y hay que ensamblar el transcriptoma.
Los errores que no se arreglan después
Confundir condición con lote. Si todas las muestras control se procesan un día y todas las tratadas otro, el efecto del tratamiento y el del día son indistinguibles. La solución es gratuita: repartir las condiciones entre los lotes y aleatorizar el orden.
Muestras que no son comparables. Tejidos con distinta proporción de tipos celulares, o animales de edades o sexos distintos sin registrar, producen diferencias que parecen biología del tratamiento.
Una réplica rara. En el análisis de componentes principales, las réplicas de una misma condición deben agruparse. Si una se va sola, hay que entender por qué antes de interpretar ninguna lista de genes.
Qué se obtiene al final
- Una tabla de recuentos por gen y muestra.
- La lista de genes diferencialmente expresados entre condiciones, con su cambio y su significancia estadística corregida por pruebas múltiples.
- Enriquecimiento funcional (GO, KEGG): qué procesos biológicos están sobrerrepresentados en esa lista.
- Figuras: componentes principales, mapas de calor, volcanes.
Un último punto: la validación de unos pocos genes por RT-qPCR es una práctica habitual y útil cuando una conclusión depende de un gen concreto, pero no es obligatoria para que el RNA-seq sea válido cuando el diseño es sólido.
Si el diseño aún está abierto, es el momento de revisarlo: después ya no se puede. Mira el alcance en RNA-seq / transcriptómica, expresión génica y qPCR / RT-qPCR, o escríbenos con tu planteamiento.